該應用描述了一種在流動下的粘附試驗，該試驗旨在研究特定細胞表面分子的作用，以確定它們在細胞附著和粘附到其他細胞類型期間的潛在相互作用。

對于我們的方法，我們使用預染色的鼠腫瘤細胞（多發(fā)性骨髓瘤：MM）和鼠內(nèi)皮細胞（EC），然后使用單克隆抗體阻斷我們感興趣的分子之一。簡而言之，將EC接種到ibidi通道μ-SlidesI0.6mmLuer中，并在恒流下培養(yǎng)24小時。為了開始共培養(yǎng)，將標記的MM細胞添加到流動容器中并繼續(xù)流動。24小時后，用抗體（以阻斷感興趣的分子）或相應的同種型對照處理裝置，并保持流動24小時。**天，將μ-Slides與流體單元(FU)斷開并清洗以去除非粘附的MM細胞。為了分析標記的MM細胞對EC的粘附，使用共聚焦顯微鏡獲得了μ-Slides的熒光圖像。

1. 材料和試劑

?MOPC多發(fā)性骨髓瘤(MM)細胞系(ATCC,TIB-23?)

?EOMA內(nèi)皮細胞(EC)系(ATCC,CRL-2586?)

?含10%FCS的RPMI培養(yǎng)基（FisherScientific，11530586）

?內(nèi)皮細胞生長培養(yǎng)基（EC培養(yǎng)基、CellBiologics、M1168）

?PBS（泛生物技術，P04-361000）

?非酶細胞解離溶液（Sigma-Aldrich，C5914-100ML）

?臺盼藍溶液（Sigma-Aldrich，93595）

?CellTracker?綠色CMFDA染料（ThermoFisher，C7025）

2. 設備和設置

?帶有2個流體單元(FU)的ibidi泵系統(tǒng)，每個單元都帶有用于2ml儲液罐的支架（ibidi，10977）

?ibidiμ-SlideI0.6mmLuer，ibiTreat（ibidi，80186）

?ibidiPerfusionSet藍色，15厘米，內(nèi)徑0.8毫米（ibidi，10961）

?ibidi過濾器/儲液罐套裝，2毫升（ibidi，10972）

?帶細胞培養(yǎng)設備的層流罩

?培養(yǎng)箱（所有培養(yǎng)步驟均在37°C和5%CO2下進行）

?帶有適當濾光片組和照相機的熒光顯微鏡

?粘度：0.0072(dynxs)/cm2

3.實驗流程

1.準備EOMA細胞稀釋液：根據(jù)制造商的說明，使用非酶細胞解離溶液分離先前培養(yǎng)的EOMA細胞。使用血細胞計數(shù)器（Neubauerchamber）對細胞進行計數(shù)。在EC培養(yǎng)基中將細胞稀釋至1.2x106個細胞/ml的濃度。

2.種入EOMA細胞：在3個 μ-SlidesI0.6mmLuer（ibidi，80186）中加入150μlEOMA細胞稀釋液（每個μ-Slide1.75x105EOMA細胞），然后孵育3小時。

表1：實驗設置

3.啟動流量：播種三小時后，將2個μ-Slides連接到流體單元FU，使用總量2.7毫升EC培養(yǎng)基。在8.2mbar的壓力下將EOMA細胞表面的剪切應力設置為0.5dyn/cm2。測量流速并使用兩個FU的平均值來計算校準因子。提前孵育FU和連接的載玻片過夜。第三個帶有EOMA細胞的μ-Slide用作靜態(tài)控制。在沒有任何流動的情況下孵育它過夜。

4.準備MM細胞：根據(jù)制造商的方案，用CellTrackerGreen(CMFDA)染料在600μlRPMI培養(yǎng)基（不含F(xiàn)CS）中染色6x105MM細胞。標記后，離心細胞并使用血細胞計數(shù)器對其進行計數(shù)。

5.開始與MM細胞共培養(yǎng)：停止流動并在無菌條件下從FU水庫中取出EC培養(yǎng)基。要開始共培養(yǎng)，將RPMI培養(yǎng)基（含10%FCS）和EC培養(yǎng)基以1:1的比例混合，并填充該混合物總體積為2.5ml，其中含有1.5x105MM注入兩個FU儲液罐。將FU重新連接到泵系統(tǒng)并繼續(xù)流動24小時。

6.分子阻斷：將MM細胞添加到ECs后24小時，用100μg/ml抗體（載玻片 #2）或相應的同種型對照（載玻片 #1）處理細胞，將它們直接添加到FU，無需更換介質(zhì)。將孵育保持在流動狀態(tài)下24小時。

7.清洗和成像：從FU上斷開μ-Slides。用PBS清洗細胞一次，以去除任何非貼壁細胞。使用共聚焦顯微鏡獲取熒光圖像，以可視化附著在EC層上的標記MM細胞。

圖1：與同種型對照處理（左圖）相比，阻斷特定表面分子（右圖）時，MM細胞對ECs的粘附性降低