1、哪種細胞密度*適合我的實驗？

通常，我們建議每孔使用5,000-10,000個HUVEC。 但是，確定*佳細胞數(shù)對于使用μ-Slide血管生成從管形成測定中獲得*佳結(jié)果是至關(guān)重要。 細胞密度取決于細胞類型和細胞大小。 因此，在開始實際實驗之前，我們建議在非抑制條件下播種幾個細胞數(shù)并對管形成進行成像。 然后，對于*佳測定條件，使用在您的實驗中產(chǎn)生*多管數(shù)的細胞密度。請記住，細胞通常不會在凝膠基質(zhì)上增殖。請參閱：血管生成實驗實驗裝置優(yōu)化和數(shù)據(jù)分析 |ibidi μ-Slide

2、應(yīng)該在哪個時間段內(nèi)觀察細胞？

管形成的持續(xù)時間取決于細胞類型和所使用的細胞外基質(zhì)，應(yīng)單獨確定。 通常，HUVEC在 2-4小時后已經(jīng)形成管。24小時后細胞開始發(fā)生凋亡，這導(dǎo)致從基質(zhì)中脫離和管破裂。請參閱：血管生成實驗實驗裝置優(yōu)化和數(shù)據(jù)分析 |ibidi μ-Slide

3、是否需要活細胞成像裝置來每小時拍攝管形成測定的照片？

非必須，通過顯微鏡對 μ-Slide 血管生成上的同一位置進行一致和**的成像。 可以使用顯示 x/y 坐標的顯微鏡載物臺或自動載物臺來完成成像。 使用自動化平臺，可以將孔的所有位置（特別是每個孔的中心）保存到位置列表中，您可以在每個時間點訪問相應(yīng)的位置。

但是，使用完整的活細胞成像設(shè)置在顯微鏡上建立生理條件要方便得多。使用ibidi Stage Top 孵育系統(tǒng)等活細胞孵育裝置有助于在成像過程中提供穩(wěn)定溫度和濕度條件，從而在體外可以直接進行視頻拍攝。

4、是否可以使用 μ-Slide 血管生成在凝膠基質(zhì)內(nèi)培養(yǎng)細胞？

可以，μ-Slide 血管生成非常適合在**定義的3D基質(zhì)中培養(yǎng)細胞。由于大界面的凝膠和頂部細胞培養(yǎng)基，凝膠中的條件可以通過更換上部儲液器中的介質(zhì)來調(diào)整。

5、應(yīng)該在管形成實驗中使用含酚紅的凝膠還是不含酚紅的凝膠？

對于使用μ-Slide血管生成的管形成測定中的相差顯微鏡，酚紅不會干擾圖片，并且由于其顏色，處理更容易。然而，當使用熒光顯微鏡時，酚紅可能會干擾探頭的波長。在這種情況下，*好使用無酚紅凝膠。

6、是否需要將μ-Slide Angiogenesis血管生成載玻片放入培養(yǎng)箱的濕室中進行凝膠聚合？

我們建議將μ-Slide血管生成載玻片放入加濕腔中進行凝膠聚合。 雖然反應(yīng)室對于聚合本身不是必需的，但它可以*大限度地減少蒸發(fā)的影響。 在高流量孵化器中，防止蒸發(fā)的足夠百分比的濕度可能不會始終保持一致。 μ-Slide血管生成中的少量凝膠會很快變干，這會導(dǎo)致彎液面的形成。

7、胎牛血清 (FBS) / 胎牛血清 (FCS) 濃度是否會影響管形成實驗中的管形成和降解速率？

一般是的。 這取決于所使用的細胞類型或細胞系。 當提供濃度高達 10% FCS 的細胞培養(yǎng)基時，我們在 μ-Slide 血管生成中觀察到典型的原代細胞 (HUVEC) 管形成和 Matrigel® 上的幾種內(nèi)皮細胞系。 但是，我們建議分別優(yōu)化每個細胞系的 FBS/FCS 濃度。

8、您是否推薦使用減少生長因子的 Matrigel® 進行管形成分析？

對于使用μ-Slide血管生成的管形成測定，我們使用了減少生長因子的 Matrigel® 和未減少的 Matrigel®。請參閱：腫瘤學(xué)必備 | 血管生成實驗介紹

9、我們希望使用減少了生長因子的 Matrigel® 和無血清培養(yǎng)基以及 50 ng/ml VEGF。 這足以刺激管的形成嗎？

可以，這種組合足以刺激ibidi血管生成實驗室器皿中的管形成，而培養(yǎng)基中沒有任何額外的生長因子。

10、除了 Matrigel® 之外，您在試管形成實驗中是否有使用其他凝膠的經(jīng)驗？

原則上，任何凝膠都可用于μ-Slide血管生成管形成實驗。 細胞可以附著在表面上是很重要的。 膠原蛋白、纖連蛋白和層粘連蛋白為細胞粘附提供了重要的結(jié)合基序。

11、什么是管形成實驗合適的陽性和陰性對照？

建議使用陽性和陰性對照來減少管形成實驗中的變量。陽性對照是預(yù)期細胞在其中形成血管的樣本（取決于實驗設(shè)置），從而向研究人員表明該實驗已正確進行。陰性對照是與所有其他樣品以相同方式處理的樣品，但預(yù)計不會顯示任何實驗結(jié)果（例如，很少或沒有管形成）。

ibidi血管生成實驗室器皿中管形成實驗的*佳陽性和陰性對照很大程度上取決于所使用的細胞、凝膠基質(zhì)和一般實驗設(shè)置。因此，我們建議您查閱文獻，了解您感興趣的主題中成功使用的對照（陽性和陰性對照）。

在下文中，您可以找到管形成測定中陽性和陰性對照的可能方法：

如果需要分析特定化合物誘導(dǎo)血管生成的效力，則可以使用用已知血管生成誘導(dǎo)劑（例如 VEGF 或 FGF2）處理的樣品作為陽性對照。濃度很大程度上取決于細胞類型和實驗設(shè)置。

如果使用原代細胞，預(yù)篩選的內(nèi)皮細胞系（例如，HUVEC）在用特定生長因子處理后表現(xiàn)出明確的反應(yīng)，可以作為陽性對照。

對于某些細胞類型，形成管的能力還取決于所使用的凝膠基質(zhì)。作為陽性對照，內(nèi)皮細胞應(yīng)在含有饑餓培養(yǎng)基（不含生長因子或血清的培養(yǎng)基）的生長因子減少的 Matrigel®上顯示管形成。如果需要測試促血管生成物質(zhì)，則使用饑餓培養(yǎng)基尤其重要，因為大多數(shù)細胞培養(yǎng)基都添加了生長因子。為了分析物質(zhì)的真實效果，基質(zhì)和培養(yǎng)基都必須不含任何生長因子。作為陰性對照，細胞可以播種在不同的基質(zhì)（例如膠原蛋白 I）上，預(yù)計不會形成管狀。

不影響細胞活力的管形成抑制劑（例如，蘇拉明或蘿卜硫素）可用作陰性對照。如果實驗的目的是測試抗血管生成物質(zhì)，則使用這種類型的抑制劑尤其重要。

如果用任何溶解的物質(zhì)（例如，在 DMSO 或乙醇中）處理細胞，則僅使用溶劑作為陰性對照。

12、是否有用于分析管形成實驗的推薦染色方案？

一般來說，相差顯微鏡足以自動分析 μ-Slide血管生成中的標準管形成實驗。 但是，如果您想研究某種標記，您可以應(yīng)用您的標準方案（例如，用于**熒光染色），但要小心，以免損壞凝膠基質(zhì)或細胞網(wǎng)絡(luò)。

使用calcein的染色方案示例可參閱：腫瘤學(xué)必備 | 血管生成實驗介紹

13、在開始實驗之前，我是否必須將 ibidi 血管生成實驗室器皿平衡到 37°C？

不，不需要平衡 μ-Slide 血管生成。 在室溫下儲存，可以立即用凝膠基質(zhì)填充。 由于μ-Slide 的開孔形式，加熱時從凝膠中逸出的氣體可以與大氣自由交換。

14、完成實驗后，μ-Slide Angiogenesis和μ-Plate Angiogenesis 96 Well可以重復(fù)使用嗎？

不可以，μ-Slide血管生成載玻片和μ-Plate血管生成96孔板是一次性耗材，僅供一次性使用。

15、μ-Slide 血管生成是否有96孔版的？

有。 μ-Plate血管生成96孔板具有與μ-Slide血管生成相同的“孔中孔”設(shè)計和凝膠體積 (10 μl)。 μ-Plate血管生成96孔可用作高通量管形成實驗的篩選板，具有完全的ANSI/SLAS (SBS) 和robotics兼容性。