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Tissuelyser-48利用CTAB法在多樣品組織研磨機(jī)上提取植物總DNA
日期：2025-11-30 07:33
瀏覽次數(shù)：1808
摘要：
一、 實(shí)驗試劑：
1.CTAB抽提液：
2%（w/v）CTAB
100 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)
20 mmol/L EDTA(pH8.0)
1.4 mol/L NaCl
抽提含多酚較多的植物材料時（比如木本植物），上述抽提液中可另加入2%的PVP（聚乙烯吡咯烷酮）。
抽提液于室溫保存，可在幾年內(nèi)保持穩(wěn)定。臨用之前向裝有上述抽提液的試管中加入約2%-3%（v/v）的β-巰基乙醇。
2、醋酸鈉：
3 mol/L NaAc
用冰乙酸調(diào)pH值至4.8-5.2。
3、TE溶液：
4、其它：
無水乙醇，異丙醇，75％乙醇，酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），氯仿：異戊醇（24：1），β-巰基乙醇，重蒸水。
二、 實(shí)驗步驟
1. 樣品研磨
1) 取1g的樣品放入2ml epp管中
2) 加入1-2粒5mm研磨珠
3) 加入1ml的CTAB 抽提液
4) 將加有樣品的epp管放入多組織研磨儀的適配器中，蓋好
5) 將研磨頻率調(diào)到60Hz，設(shè)定研磨時間為90秒（可根椐樣品的研磨的難易程度來調(diào)節(jié)，此數(shù)據(jù)是以銀杏落葉為樣本得出）
6) 啟動研磨儀對樣品進(jìn)行研磨（根據(jù)不同的樣品，本身性質(zhì)不同，需要對研磨頻率和研磨時間進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整）
2. DNA的粗提
1) 將研磨好的樣品取出于65℃水浴45min，中途間隔（輕柔）振蕩三次混勻
2) 冷卻后加入等體積氯仿：異戊醇（24：1），輕柔顛倒混勻使乳化10min
3) 7000g-8000g離心10min（18-20℃）
4) 吸取上清于另一干凈的離心管中
5) （根據(jù)需要可用氯仿：異戊醇如上法重復(fù)抽提一次，吸取上清）
6) 加入與上清液等體積（且已于-20℃預(yù)冷的異丙醇，顛倒混勻，約1至2分鐘后應(yīng)有白色絮狀沉淀出現(xiàn)（若沒有，則加入上清液1/5至1/10體積的pH4.8-5.2的3M NaAc,混勻，于－20℃冰箱中沉淀30min）
7) 離心法沉淀DNA
8) 在75%乙醇中漂洗DNA數(shù)分鐘以上，用Tip頭吸干乙醇
9) 用1ml 75%乙醇再漂洗一次
10) 沉淀于室溫或64℃以下的恒溫箱中干燥片刻至剛出現(xiàn)半透明，不要過度干燥
11) 用50μlTE溶解沉淀，可用65℃水浴助溶，DNA粗提物可用于粗略PCR等。
3. DNA的純化
1) 向TE溶解的DNA粗提物中入4-10μl RNaseA(約40-100μg)
2) 于37℃酶解RNA 1hr或65℃酶解RNA 30min以上
3) 加入50μl酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），輕輕顛倒混勻10min
4) 10000g以上常溫離心10min，吸取上清
5) 加入50μl仿氯：異戊醇（24：1）輕輕顛倒10min
6) 10000g以上常溫離心10min，吸取上清 (根據(jù)需要可重復(fù)用氯仿：異戊醇如上法再抽提1-2次，以充分去除蛋白和酚)
7) 向上清中加入1/5-1/10體積的pH4.8-5.2的3M NaAc,并加入2.5倍體積無水乙醇，于－20℃沉淀30min以上
8) 12000g、4℃低溫離心10min,吸干液體
9) 沉淀用75％乙醇漂洗二次
10) 沉淀于室溫或64℃以下恒溫箱中干燥片刻至剛開始出現(xiàn)半透明狀，勿過度干燥加入50μl重蒸水溶解DNA，可于65℃水浴助溶
11) 取5μl DNA電泳檢查DNA的質(zhì)量
12) 100-500倍稀釋后于分光光度計上測定OD260及OD280，分析DNA的濃度和質(zhì)量
13) 保存DNA于-20℃
補(bǔ)充：如果需要提取的樣品比較多（比如1g），研磨好的樣品在后續(xù)的提取中，需要轉(zhuǎn)移到大的epp管中，研磨時可以加入較少的抽提液，研磨完畢按照1g樣品10ml提取液補(bǔ)充抽提液，進(jìn)行后續(xù)的操作。
