內(nèi)皮層的細(xì)胞與細(xì)胞間的聯(lián)系對(duì)于其發(fā)揮正常的生理作用有非常重要的作用。細(xì)胞間聯(lián)系不僅會(huì)影響包括囊泡的釋放和白血球滲出，并進(jìn)一步影響血管生成過(guò)程。荷蘭的科學(xué)家發(fā)現(xiàn)RNA-binding protein quaking(QKI)表達(dá)收到流動(dòng)狀態(tài)的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的影響。流動(dòng)刺激下，其表達(dá)時(shí)間變長(zhǎng)，并且轉(zhuǎn)錄因子KLF2會(huì)結(jié)合到其啟動(dòng)子上。進(jìn)一步，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)quaking會(huì)直接和VE-cadherin和β-cadherin的mRNA相結(jié)合，并且能通過(guò)3’UTR直接誘導(dǎo)mRNA的翻譯。

科學(xué)家們將HUVECs種在通道載玻片上，并且為其提供10dyne/cm²的持續(xù)的剪切力，進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)7天的培養(yǎng)。之后，科學(xué)家們分析流體剪切力處理后的細(xì)胞表達(dá)的RNA并且直接對(duì)其進(jìn)行**熒光染色。

一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備

1）細(xì)胞： HUVECs

2）試劑： 3.7% formalin （Millipore）

          0.5% Triton X-100 （Sigma-Aldrich)

          Hank’s Balanced Salt Solution containing Ca²⁺ and Mg²⁺   （HBSS Gibco）

3）培養(yǎng)耗材：ibidi六通道載玻片μ-Slide VI^0.4 Luer （ibidi，Germany，80606）

             灌流管，15cm，1.6mm直徑（ibidi，Germany，10962）

             串聯(lián)管（ibidi，Germany，10830）

             封口夾

4）儀器設(shè)備：ibidi流體剪切力系統(tǒng)，含空氣泵（ibidi，Germany，10905）和流體單元（ibidi，Germany，10903）

二、實(shí)驗(yàn)方法

在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前**，請(qǐng)將所有需要使用的試劑，培養(yǎng)基，通道載玻片，灌流管都在37℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中放置過(guò)夜，排除由于溫度差產(chǎn)生的微量氣泡。

一）培養(yǎng)細(xì)胞

準(zhǔn)備HUVECs，按照常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)。*好使用比較健康的內(nèi)皮細(xì)胞，以防在做流體實(shí)驗(yàn)時(shí)候細(xì)胞不能穩(wěn)定貼壁。

按照下面流程鋪細(xì)胞：

1）按細(xì)胞密度為1.5* 10 ⁶ cell/ml 鋪細(xì)胞，注意，將移液器頭插入注液孔中再加入細(xì)胞懸液，可以輕微傾斜通道載玻片幫助細(xì)胞懸液充滿整個(gè)通道。

2）蓋上注液孔蓋，將通道載玻片放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)半小時(shí)，等待細(xì)胞貼壁。細(xì)胞貼壁后，拿出通道載玻片，在每個(gè)注液孔中分別加入60μl培養(yǎng)基，注意，槍頭要懸在孔上方滴入培養(yǎng)基。

3）將通道載玻片再放入二氧化碳培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)3小時(shí)左右，等到細(xì)胞剛剛長(zhǎng)滿為單細(xì)胞層，即可開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。注意，要使用單層細(xì)胞進(jìn)行剪切力實(shí)驗(yàn)，使每個(gè)細(xì)胞均受到均勻的剪切力。

二）搭建流體系統(tǒng)

1）將灌流管按照說(shuō)明放在置在流體單元上。在灌流管的儲(chǔ)液管中分別加入8ml培養(yǎng)基。這時(shí)不需要連接通道載玻片。實(shí)驗(yàn)前需要去除整個(gè)灌流管中的氣泡，存留在灌流系統(tǒng)的氣泡會(huì)影響剪切力的大小，有時(shí)還會(huì)使灌流系統(tǒng)中的液體流動(dòng)停滯。打開(kāi)ibidi泵控制系統(tǒng)，在任務(wù)欄中找到“Remove air bubbles”，ibidi流體剪切力系統(tǒng)將自動(dòng)運(yùn)行下面任務(wù)，用于去除氣泡。

（表一）

2）連接通道載玻片。使用串聯(lián)管，將通道串聯(lián)起來(lái)。這樣可以在同一個(gè)條件，同一種液體的刺激下培養(yǎng)不同的樣本。

在細(xì)胞貼壁后，將串聯(lián)管如如圖示插入串聯(lián)管

在每一個(gè)注液孔中加滿培養(yǎng)基，要注意不能把氣泡加入在注液孔中。

用1ml的無(wú)菌注射器吸滿培養(yǎng)基，小心插入如圖的孔中，不要引入氣泡。

小心推入培養(yǎng)基，直到**個(gè)串聯(lián)管有培養(yǎng)基微微冒出。

小心的將串聯(lián)管彎過(guò)來(lái)，插入相鄰的注液孔中。不要產(chǎn)生氣泡。

繼續(xù)推動(dòng)注射器，直到**根串聯(lián)管也被充滿，繼續(xù)推動(dòng)注射器充滿下一根串聯(lián)管。

重復(fù)上面的操作，繼續(xù)充滿所有的通道和串聯(lián)管。

將所有的串聯(lián)管連接好后，將加滿液體排除氣泡的灌流管用封口夾夾住。

小心將灌流管的一個(gè)魯爾接頭從聯(lián)通管中拔出，插入*后一個(gè)注液孔中。

小心將注射器移除，在注液孔中加滿培養(yǎng)基，將灌流管的另一個(gè)接頭插入。

串聯(lián)灌流系統(tǒng)搭建完成。

3）流體剪切力實(shí)驗(yàn)及**熒光實(shí)驗(yàn)  實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞受到穩(wěn)定的10dyne/cm² 刺激。持續(xù)培養(yǎng)7天，并在第**和第四天更換全部培養(yǎng)液。整個(gè)系統(tǒng)一直置于37℃，5% CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)好的細(xì)胞用3.7% formalin固定10分鐘并用Triton X-100通透2分鐘。在使用含1%BSA和HBSS溶液封閉1小時(shí)后分別加入一抗二抗染色。

三 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在流體剪切力刺激下的內(nèi)皮細(xì)胞中OKI上調(diào)表達(dá)。如圖所示，a)RT-PCR 檢測(cè)的在靜置培養(yǎng)和流動(dòng)培養(yǎng)的HUVEC中提取的Klf2和Nos3的mRNA的量。b）**熒光染色顯示兩種培養(yǎng)條件下HUVEC中的NOS3（綠色）或 VE-cadherin（綠色）和細(xì)胞核（藍(lán)色）或F-actin（紅色）。c）兩種培養(yǎng)條件下HUVEC細(xì)胞中 Qki5，Qki6和Qki7的RT-PCR結(jié)果。d）兩種培養(yǎng)條件HUVEC中提取的蛋白的**印跡對(duì)比。e) 兩種培養(yǎng)條件下HUVEC細(xì)胞中 Qki5，Qki6和Qki7的**熒光（綠色）檢測(cè)結(jié)果。