美國(guó)的科研人員通過對(duì)TTF-1的調(diào)控發(fā)現(xiàn)，TTF-1能直接調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF），并且發(fā)現(xiàn)VEGF啟動(dòng)子上有多處TTF-1響應(yīng)序列。 比如，VEGF的主要受體，VRGFR2顯示出收到TTF-1的直接正調(diào)節(jié)。本文中顯示，低氧并沒有促進(jìn) TTF-1+肺癌細(xì)胞中的VEGF的表達(dá)。而采用外泌體培養(yǎng)基或者是去外泌體的培養(yǎng)基（EDM）時(shí)，TTF-1都能促進(jìn)VEGF表達(dá)。但在研究中意外的發(fā)現(xiàn)TTF-1+肺癌細(xì)胞的去外泌體培養(yǎng)基（EDM-TTF-1+）能夠內(nèi)皮細(xì)胞的血管形成。

研究人員采用HUVECs，鋪在基質(zhì)膠上，加入EDM以及VEGFR1等蛋白質(zhì)后孵育2-3小時(shí)，對(duì)比不同條件下的分枝數(shù)和節(jié)點(diǎn)數(shù)。

Thyroid Transcription Factor 1 Reprograms Angiogenic Activities of Secretome
L. Wood, N. Cox, C. Phelps, S. Lai, A. Poddar, C. Talbot and D. Mu
Scientific Reports, 2016, 10.1038/srep19857

（一）實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)方法
1）細(xì)胞：       HUVECs                                 104 cells/50μl
2）培養(yǎng)基：      RPMI
3）基質(zhì)膠：    Basement membrane (Fisher Scientific, CB40234A)    10 μl per well
4) 試劑：     A549 conditioned media (EDM)
             Recombinant human GM-CSF protein（250ng/ml，Peprotech，300-03）
             sVEGFR1 protein（20 ng/ml, RayBiotech,ELH-VEGFR1)
             Anti-GM-CSF antibody (R&D systems. MAB215)
             Anti-VEGFR1 antibody (R&D systems. AF321) 
5）耗材：    ibidi血管生成載玻片  (ibidi, 81506) 
6）其他：        細(xì)格紙                                   
           

（二）實(shí)驗(yàn)步驟
1）準(zhǔn)備基質(zhì)膠
①　將10μl的Basement membrane以5mg/ml的濃度鋪入ibidi血管生成載玻片的內(nèi)孔中，注意槍頭要垂直于內(nèi)孔的正上方加入Matrigel，防止有Matrigel流經(jīng)上孔而留下殘留膠。
②　蓋上ibidi血管生成載玻片的蓋子。
③　準(zhǔn)備一個(gè)10cm的培養(yǎng)皿，放入浸過水的紙巾，制成一個(gè)濕盒。
④　將ibidi血管生成載玻片放入培養(yǎng)皿中，蓋上培養(yǎng)皿蓋。
⑤　37℃至少孵育30分鐘，使基質(zhì)膠完全固化。


怎么知道加了合適體積的Matrigel：
由于Matrigel流動(dòng)性不強(qiáng)，并且有可能移液槍不準(zhǔn)確，有可能10μl的膠不能填滿ibidi血管生成載玻片的下孔，這樣，必然會(huì)影響到實(shí)驗(yàn)的成像結(jié)果。這時(shí)用一張格子紙就能知道移液槍調(diào)整到多少能正好把下孔填滿。

如上圖所示，垂直透過每個(gè)孔看下面的格子紙，如果格子被縮小了，那么就說明膠沒加滿，格子被放大了，那么膠就加多了，格子沒發(fā)生什么變形，這才是剛剛加滿下孔的狀態(tài)。


3）鋪細(xì)胞

①　在培養(yǎng)好的HUVECs細(xì)胞的60mm培養(yǎng)皿中加入5μg 的 Calcein-AM，染色45分鐘。
②　胰酶消化細(xì)胞制成懸液，每孔種10000個(gè)細(xì)胞即可。準(zhǔn)備密度為2*105cells/ml的細(xì)胞懸液，充分混勻。
③　將膠已經(jīng)凝固的ibidi血管生成載玻片從濕盒中取出。
④　每孔加入50μl的細(xì)胞懸液，注意保持槍頭垂直在上孔的上方，不要接觸下孔的凝膠。可以使用排槍。
⑤　同樣用格子紙查看是不是加了足夠量的液體，如果沒有，加入無細(xì)胞的培養(yǎng)基，使上孔液體正好加滿。
⑥　蓋上蓋，靜置，一段時(shí)間后，所有細(xì)胞都會(huì)沉下去落在Matrigel的表面。

4）不同培養(yǎng)基處理
采用EDM-EV，EDM-HDD，EDM-TTF-1處理細(xì)胞，并分別加入 rGM-CSF和rsVEGFR1，以Goat Ab和 Mouse Ab作為對(duì)照。37℃，培養(yǎng)2-3小時(shí)。
5）采集圖像并統(tǒng)計(jì)結(jié)果
使用尼康TS100顯微鏡的40倍鏡采集圖像，并且用 ImageJ對(duì)其分枝數(shù)和節(jié)點(diǎn)數(shù)進(jìn)行測(cè)量和統(tǒng)計(jì)。

三）實(shí)驗(yàn)結(jié)果


如圖所示，使用EDM-TTF1處理的HUVECs血管生成被顯著的抑制。當(dāng)加入GM-CSF和VEGFR1后，血管生成也被顯著的抑制，但當(dāng)加入GM-CSF和VEGFR1的抗體后，血管生成的抑制也被取消，細(xì)胞又顯出很強(qiáng)的血管生成結(jié)果。說明TTF-1上調(diào)了GM-CSF和VEGFR1的表達(dá)，抑制了血管生成的進(jìn)程。