1.介紹

ibidi泵系統(tǒng)/流體剪切力系統(tǒng)是專為灌注條件下的長期細(xì)胞調(diào)節(jié)而設(shè)計。標(biāo)準(zhǔn)方法是將一個載玻片連接到一個灌注裝置。在某些情況下，增加載玻片（細(xì)胞）的數(shù)量可能是有用的。例如，當(dāng)計劃進(jìn)行各種染色時，或者如果細(xì)胞數(shù)量對于后續(xù)的應(yīng)用（如FACS）不夠時。

本應(yīng)用是一個循序漸進(jìn)依次連接μ-Slide VI0.4六通道載玻片的實驗方案。

重要提示！

串聯(lián)的通道承受著幾乎相同的流速，因此剪切應(yīng)力也幾乎相同。

我們強(qiáng)力建議串聯(lián)通道載玻片，而不是并聯(lián)！

我們建議按所述方式連接不要超過兩個μ-Slide VI0.4 六通道載玻片

2.材料

對于設(shè)置，需要以下材料(無菌):

* 串聯(lián)連接管(ibidi #10830)，5 pieces

* 細(xì)胞培養(yǎng)基

* 接種了細(xì)胞的ibidi μ-Slide VI 0.4

* 灌流管

* 1 ml注射器

* 軟管夾

* 移液吸頭

重要提示！

將串聯(lián)連接管、細(xì)胞培養(yǎng)基、通道載玻片和灌注裝置在培養(yǎng)箱中平衡一整晚!

本方案的所有步驟都應(yīng)在無菌條件下完成!

3.準(zhǔn)備工作

整個設(shè)置相當(dāng)于只有一個通道的標(biāo)準(zhǔn)實驗。 **的區(qū)別是，在將整個組件連接到Perfusion Set之前，先將多個通道串行連接起來。

3.1.接種細(xì)胞

像往常一樣在μ-Slide VI 0.4的通道中接種細(xì)胞。如果需要進(jìn)一步的靜態(tài)培養(yǎng)，讓細(xì)胞附著并在附著后用60μl無細(xì)胞培養(yǎng)基填充儲液池。詳細(xì)說明見“使用ibidi流體剪切力系統(tǒng)培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞實驗方法匯總”。細(xì)胞貼壁后，就可以進(jìn)行載玻片的串連了。

3.2.泵設(shè)置

按照“使用ibidi流體剪切力系統(tǒng)培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞實驗方法匯總”中的說明準(zhǔn)備泵的設(shè)置。向灌流管的儲液池中各注入5ml平衡介質(zhì)，并以中壓(約50mbar)運行泵，去除氣泡。

重要提示！

將公魯爾接頭連接到母魯爾接頭時，務(wù)必小心不要帶進(jìn)氣泡。

盡可能快地工作，以避免載玻片和細(xì)胞冷凝。整個過程必須在10分鐘內(nèi)完成。

4.串聯(lián)連接

通道的串聯(lián)連接是在細(xì)胞貼壁后和將載玻片連接到灌注管之前完成。

按照第3部分的描述準(zhǔn)備載玻片，接種細(xì)胞并貼壁        如圖所示，將五個串行連接管連接到Luer端口

用無細(xì)胞培養(yǎng)基填充注液孔，直到所有注液孔完全充滿    在此步驟中，注意注液孔底部不能有氣泡

注意不能在注液孔中留有氣泡

用1ml的無菌注射器吸滿培養(yǎng)基，小心插入如圖的孔中，不要引入氣泡。

小心慢慢注入培養(yǎng)基，直到**個串聯(lián)管有培養(yǎng)基微微冒出

小心的將串聯(lián)管彎過來，插入相鄰的Luer端口中。不要產(chǎn)生氣泡。

繼續(xù)推動注射器，直到**根串聯(lián)管也被充滿，繼續(xù)推動注射器充滿下一根串聯(lián)管。

重復(fù)上面的操作，繼續(xù)充滿所有的通道和串聯(lián)管。

將所有的串聯(lián)管連接好后，將加滿液體排除氣泡的灌流管用軟管夾夾住。

從灌流管的母魯爾鎖定耦合器中拔出公魯爾接頭，并將其插入載玻片上末尾一個Luer端口中。在慢慢抽出注射器，用新鮮的培養(yǎng)基填滿Luer端口并去除氣泡

從灌流管的母魯爾鎖定耦合器中拔出**個公魯爾接頭，并將其插入載玻片上另一端末尾的Luer端口

設(shè)置完成，可開始啟動實驗。別忘了取下軟管夾！

串聯(lián)灌流系統(tǒng)搭建完成。

5.調(diào)整流速

軟件中無法預(yù)見多個通道載玻片的設(shè)置。需要調(diào)整泵的參數(shù)以適應(yīng)新的要求。作為指南您可以在軟件中選定正在使用是μ-Slide VI0.4通道載玻片。由此產(chǎn)生的流速(以及剪切應(yīng)力)將低于在單通道的應(yīng)用中。用所需的剪切應(yīng)力啟動一個循環(huán)，手動測量流速(ibidi Pump Instructions, page 40（可聯(lián)系我們索要電子版文檔）)。然后進(jìn)入重新校準(zhǔn)對話框，輸入計算的（軟件給定的流速）和測量的流速。