小鼠 L929 成纖維細(xì)胞的多細(xì)胞球體是在μ-Slide 球體灌注中創(chuàng)建的。在從細(xì)胞懸浮液中形成球體后，使用 ibidi 泵系統(tǒng)進(jìn)行灌注。添加 ibidi Pump 可確保球體在長期培養(yǎng)過程中獲得*佳營養(yǎng)。

在灌注培養(yǎng) 1 周后，將球體固定并用鬼筆環(huán)肽染色以觀察 F-肌動蛋白細(xì)胞骨架。*后，球體被**以增強(qiáng)成像深度和分辨率。我們使用EMOVI 方法進(jìn)行具有成本效益、無害的整體成像，這可以在固定球體上實現(xiàn)基于抗體的多重**標(biāo)記。球體的**允許分析整個球體成纖維細(xì)胞甚至在球體成纖維細(xì)胞中心的成纖維細(xì)胞的分布和組織，同時保留球體的形態(tài)

01材料和試劑

細(xì)胞和試劑

?L929成纖維細(xì)胞（DSMZ，編號ACC 2）

?Accutase(A1110501,Gibco)

?細(xì)胞培養(yǎng)基 RPMI-1640 (Gibco, 21875034)

?胎牛血清 (FCS, Gibco, 10270106)

?細(xì)胞內(nèi) (IC) 固定緩沖液 (eBioscience, 00-8222-49)

?Dulbecco 磷酸鹽緩沖液（PBS、Sigma、D8537）

?正常小鼠血清（Jackson，015-000-120）

?正常驢血清（Jackson，AB_2337258）

?Triton X-100（Alfa Aesar，A16046）

?Flash Phalloidin? Green 488（鬼筆環(huán)肽；500x，Thermo Fisher Scientific，46410）

?4'，6-二脒-2-苯基吲哚（DAPI，濃度20μg/mL，西格瑪奧德里奇，D9542）

?去離子水 (diH2O)

?異丙醇（Carl Roth，CP41.2）

?肉桂酸乙酯 (ECi) (Sigma, W243000)

02緩沖液和溶液

培養(yǎng)基

?新鮮制備并在 4°C下儲存長達(dá)一周

?基礎(chǔ)培養(yǎng)基 RPMI-1640 (Gibco, 21875034)

?10%  FCS （ Gibco，10270106）

封閉和染色緩沖液

?PBS 

?1% （v/v）FCS 

?1% (v/v) 正常小鼠血清

?1% (v/v) 正常山羊血清

?0.3% (v/v) Triton  X-100

染色液

?封閉和染色緩沖液

?1:500 鬼筆環(huán)肽（*終濃度 1x）

?1:10 DAPI（*終濃度 2 μg/mL）

30% / 50% / 70% (v/v) 異丙醇稀釋液

?混合適當(dāng)體積的 diH2O 和異丙醇

?使用前預(yù)冷至 4 °C

03 設(shè)備   

?ibidi 泵系統(tǒng) (ibidi, 10902)

?具有生物惰性表面鈍化的 ibidi μ-Slide 球體灌注（ibidi，80350）

?用于 μ-Slide 的 ibidi 串行連接器（ibidi，10830）

?ibidi 灌注套裝藍(lán)色 (ibidi, 10961)

?層流罩

?培養(yǎng)箱，37°C 和 5% CO2

?血細(xì)胞計數(shù)器（康寧)

?移液器(康寧）

?倒置共聚焦顯微鏡（Leica TCS SP8）

?徠卡應(yīng)用套件 X

?LIGHTNING（反卷積軟件）

?Imaris v9.5

04 操作程序

**部分：μ-Slide球體灌注中的球體形成和培養(yǎng)

請在使用 μ-Slide Spheroid Perfusion 之前閱讀指示。所有步驟均需在無菌條件下執(zhí)行。

開始實驗之前，在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)瓶（例如 T75）中制備 L929 成纖維細(xì)胞，細(xì)胞粘附在底部。細(xì)胞在實驗當(dāng)天應(yīng)該是健康的并且*佳亞匯合。

重要提示：在 37°C 和 5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)過夜平衡所有必需的材料，例如載玻片、培養(yǎng)基和管道（灌注套件）。平衡對于防止氣泡隨著時間的推移而出現(xiàn)至關(guān)重要。

1. 將60 μl 無細(xì)胞培養(yǎng)基注入 μ-Slide Spheroid Perfusion 的每個通道（根據(jù)說明用提供的蓋玻片封閉）

2. 在培養(yǎng)箱中 37°C 孵育 2 小時。孵育期間始終關(guān)閉蓋子。

3. 用 Accutase 處理培養(yǎng)的 L929 細(xì)胞 1-2 分鐘以使其脫離。

4. 收集細(xì)胞懸液，離心，在培養(yǎng)基中稀釋；量取決于所需的細(xì)胞濃度。

5. 對細(xì)胞計數(shù)并調(diào)整至終濃度為 5 x 105cells/ml。

6. 用無細(xì)胞培養(yǎng)基沖洗 μ-Slide 球體灌注的通道，以去除潛在的氣泡。

7. 將 45 μl 細(xì)胞懸液直接移入每個通道。

8. 在 37°C 下孵育 1 小時，使細(xì)胞在壁孔中沉淀。

9. 用60 μl 無細(xì)胞培養(yǎng)基填充 μ-Slide Spheroid Perfusion 的儲液庫。

10. 在 37°C 下孵育過夜以形成球體。

11. 檢查通道是否有氣泡。如果通道中存在任何氣泡，請用無細(xì)胞培養(yǎng)基小心沖洗通道。

12. 使用ibidi 串行連接器連接 μ-Slide Spheroid Perfusion 的 3 個通道

13. 根據(jù)ibidi 泵系統(tǒng)、流體單元和灌注裝置指示.

14. 將μ-Slide 球體灌注連接到 ibidi 泵系統(tǒng)并開始流動。使用盡可能低的流速（5 mBar 氣壓導(dǎo)致流速為 0.74 ml/min）。進(jìn)行實驗，直到球體具有所需的成熟狀態(tài)，在這種條件下培養(yǎng) 7 天后。

圖1：L929 成纖維細(xì)胞在孔中形成球體并在流動條件下培養(yǎng)

圖 2：L929 成纖維細(xì)胞在μ-Slide 球體灌注中顯示球體形成。第1 天的示例

(A)第 6 天 (B)，使用 ibidi 泵系統(tǒng)灌注，0.74 毫升/分鐘。相差顯微鏡，10 倍物鏡，井徑 800 μm。

**部分：L929 球體的染色和**

染色直接在 μ-Slide Spheroid Perfusion 中進(jìn)行。在開始染色之前，請閱讀指示并遵循載玻片中關(guān)于一般移液和更換溶液的建議。

1. 當(dāng) L929 球體培養(yǎng)達(dá)到所需的成熟狀態(tài)（此處為 7 天后）時，小心地斷開 μ-Slide球體灌注與 ibidi 泵系統(tǒng)的連接。

2. 在 RT 處用冷 IC 固定緩沖液固定球體 10 分鐘。

3. 在 RT 中將球體封閉和染色緩沖液中孵育 1 小時。

4. 在 37°C 下用染色溶液孵育球體過夜。從這一點開始，保持載玻片避光。圖 3A 顯示了**前的球體成像。

5. **天，用 Blocking and Staining Buffer 清洗細(xì)胞一次。

6. 通過在冰上以上升 30%、50% 和 70% 的異丙醇稀釋液孵育15 分鐘，依次使球體脫水。

7.  在冰上用純異丙醇孵育球體兩次 15 分鐘。

8.  從冰中取出載玻片，讓它升溫至 RT。

9.  執(zhí)行**：在 RT 處用純 ECi 灌注兩次。在這個階段，球體可以避光儲存數(shù)周，而不會顯著損失熒光。

10.  使用共聚焦顯微鏡的圖像球體（參見圖 3）。

圖 3：**前后染色 L929 球體的共聚焦顯微鏡（紅色：鬼筆環(huán)肽，青色：DAPI）。

(A) **前的球體。請注意，由于光散射和吸收，只能看到外圍細(xì)胞，而看不到中心的細(xì)胞。(B, C) **后的球體。請注意，清洗前后的尺寸差異源于脫水和清洗過程，同一位置的橫截面。(B) 橫截面 (C) 體積/3D 視圖。球體的**允許即使在球體成纖維細(xì)胞的中心也可以看到細(xì)胞，同時保留球體的形態(tài)。細(xì)胞核的計數(shù)甚至可以確定形成該球體的細(xì)胞數(shù)。

點擊請查看**前后染色球體的直接對比視頻 (z-stack of 440 slices at a slice spacing of 0.36 μm)。

注：此實驗方案來自ibidi的實際用戶，更多詳情可聯(lián)系本文作者E-mail address: selina.keppler@tum.de

僅供科研使用！